Domięśniowe podanie wirusa parapleginy ratuje aksonopatię obwodową w modelu dziedzicznej paraplegii spastycznej ad 9

Całkowitą dawkę 1011 GC każdego preparatu wektorowego wstrzyknięto 3 różnym miejscom brzuchatego łydki (3 wstrzyknięcia po 30 ul), stosując strzykawkę Hamiltona o masie 100 jl. Alternatywnie, 1012 GC AAV2 / wstrzyknięto do żył ogonowych myszy C57BL / 6 (n = 3). W celu barwienia LacZ zwierzęta uśmiercono 4 tygodnie po iniekcji i perfundowano przezsercowo 2% PFA / 0,5% aldehydem glutarowym w PBS. Tkanki zamrożono kriogenicznie w 30% roztworze sacharozy i poddano obróbce w celu barwienia X-gal stosując standardowe techniki, albo jako preparaty do całego podłoża (mięsień szkieletowy) albo po kriosukcji (rdzeń kręgowy). Leczenie in vivo wektorami AAV-Spg7. Myszy znieczulano za pomocą inertyny i wykonano nacięcie o długości 2-3 mm w skórze, aby odsłonić mięśnie brzuchatego łydki i czworogłowy. Całkowitą dawkę 1011 GC każdego preparatu wektorowego wstrzyknięto w 3 różne miejsca mięśnia brzuchatego łydki i mięsień czworogłowy (3 wstrzyknięcia po 30 ul), stosując strzykawkę Hamiltona o masie 100 jl. Myszy traktowano zgodnie z 2 protokołami eksperymentalnymi. W pierwszym ustawieniu eksperymentalnym, 10-miesięczny Spg7. /. myszom wstrzyknięto jednostronnie AAV2 / 2-Spg7 (n = 12) lub AAV2 / 1-Spg7 (n = 8). W obu przypadkach strona przeciwna została wstrzyknięta wektorem AAV-LacZ do kontroli wewnętrznej. Zwierzęta trzymano przez 6 miesięcy przed uśmierceniem w celu analizy metodą Western blot, histologiczną i ultrastrukturalną. Wiek w momencie analizy wynosił 16 miesięcy. W drugim ustawieniu eksperymentalnym, 3-miesięczny Spg7. /. myszy (n = 13) z różnych miotów traktowano dwustronnie AAV2 / 2-Spg7. Grupę kontrolną myszy Spg7 (3 w tym samym wieku (n = 13) leczono obustronnie AAV-LacZ. Wszystkie myszy badano w aparacie rotarod raz w miesiącu przez następne 10 miesięcy, a ich działanie porównywano z wydajnością dopasowanej do wieku grupy myszy Spg7 + / + (n = 9). Po 10 miesiącach AAV-Spg7. i myszy traktowane AAV-LacZa uśmiercono w celu analizy histologicznej w celu określenia ilościowego ratowania fenotypu neuropatologicznego. Wiek w chwili analizy histologicznej wynosił 13 miesięcy. Western blot. Analizę Western blot przeprowadzono na Spg7P /. myszy wstrzyknięto jednostronnie w mięśnie brzuchatego łydki i mięsień czworogłowy AAV2 / 1-Spg7 (n = 2) i AAV2 / 2-Spg7 (n = 1) po 10 miesiącach i uśmiercano 6 miesięcy później (patrz powyżej). Mitochondria wyizolowano z mięśnia brzuchatego łydki i lędźwiowego rdzenia kręgowego, jak opisano wcześniej (11). Około 50 .g białek mitochondrialnych oddzielono przez SDS-PAGE i przeniesiono na nitrocelulozę. Filtry inkubowano z określoną surowicą odpornościową przeciwko antyparapleginie (11). Barwienie nerwowo-mięśniowe. Izolowane mięśnie utrwalano w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M PBS przez 15 minut. Następnie mięśnie rozerwano i inkubowano w 0,1 M PBS przez 10 minut w celu usunięcia utrwalacza przed znakowaniem receptorów acetylocholiny przez inkubację na wytrząsarce przez 20 minut w temperaturze pokojowej w obecności mg / ml P-afrarotoksyny skoniugowanej z tetrametylo-rodaminą. izotiocyjanian (Invitrogen Corp.). Po 3 przemyciach PBS, mięśnie najpierw permeabilizowano 0,5% Tritonem X-100 (Sigma-Aldrich) w buforze blokującym (10% surowicy koziej w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano w pierwotnym przeciwciele monoklonalnym bezpośrednio przeciwko 200- białka neurofilamentu kDa (NF200, fosforylowane i niefosforylowane, Sigma-Aldrich) rozcieńczone 1: 400 w 1% surowicy koziej w PBS na wytrząsarce w 4 ° C przez noc. Następnego dnia rano preparaty przemyto w PBS i inkubowano na wytrząsarce przez 4 godziny w temperaturze pokojowej w 1% surowicy koziej w PBS zawierającej rozcieńczenie 1: 100 koziego przeciwciała antymysiego skoniugowanego z FITC znakowanym fluorescencją (Dako).
[przypisy: andzela allegro, allegro hantle, bartoneloza ]