Krytyczna rola zewnątrzkomórkowej izomerazy dwusiarczku białka podczas tworzenia skrzepliny u myszy ad 7

Ponadto PDI stanowi unikalny cel przeciwzakrzepowy dla nowych farmaceutyków, ponieważ jego hamowanie blokuje zarówno powstawanie zakrzepu płytek, jak i tworzenie fibryny. Jednak entuzjazm dla tego podejścia musi zostać złagodzony na podstawie starannej oceny w modelach zwierzęcych możliwego stosunku korzyści do ryzyka takich interwencji. Metody Myszy. Myszy C57BL / 6J typu dzikiego otrzymano z The Jackson Laboratory. Par4. /. myszy na tle C57BL / 6J zostały wcześniej opisane (18) i scharakteryzowane w modelu uszkodzenia laserowego (19). Ośrodek ds. Opieki nad zwierzętami i ich użytkowania w Beth Israel Deaconess Medical Center zatwierdził wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentalne. Przeciwciała i odczynniki. Przeciwciało anty-mysie CD41 szczura (klon MWReg30) pochodziło od Emfret. Mysie przeciwciało monoklonalne RL90 anty-PDI, IgG2a z Affinity BioReagents i mysie ludzkie przeciwciało monoklonalne anty-ludzka fibryna II (klon NYBT2G1) z Accurate Chemical oczyszczono przez chromatografię powinowactwa stosując Protein A / G. Mysie IgG2a i IgG1 otrzymano z BioLegend. Fragmenty Fab przeciwciała anty-CD41 wytworzono przy użyciu zestawu do przygotowywania ImmunoPure Fab z Pierce Biotechnology. Bacytracynę A (Vetranal) otrzymano z Sigma-Aldrich jako wolną od proteazy. Ten materiał nie wykazywał aktywności proteazy. Bacytracynę Sigma-Aldrich następnie oczyszczono metodą HPLC zgodnie z instrukcjami producenta. Królicze poliklonalne przeciwciało przeciw PDI bydlęce, które reaguje krzyżowo z ludzkim i mysim PDI otrzymano z Sigma-Aldrich i, dla niektórych eksperymentów, oczyszczono za pomocą powinowactwa z bydlęcym PDI kowalencyjnie połączonym z agarozą aktywowaną bromkiem cyjanogenu. Fragmenty Fab przeciwciała anty-CD41, mysie przeciwciało anty-fibrynowe, poliklonalne przeciwciała anty-PDI i monoklonalne przeciwciało RL90, jak również mysie IgG2a lub poliklonalne nieimmunologiczne przeciwciała IgG znakowano Alexa Fluor 488 lub Alexa Fluor 647 zgodnie z danymi producenta. instrukcje (Invitrogen). Stosunek molowy Alexa Fluor do białka, określony spektrofotometrycznie, wahał się od 2,0 do 3,5. Przygotowanie lizatów płytek krwi. Osocze ludzkie bogate w płytki krwi przygotowano przez odwirowanie ludzkiej krwi potraktowanej cytrynianem sodu przy 200 g przez 20 min. Supernatant zebrano i odwirowano przy 700 g przez 10 min w obecności 0,5 .M prostaglandyny E1 (PGE1), 500 ng / ml prostacykliny (PGI2) i 2 U / ml apyrazy. Osad ponownie zawieszono w buforze HEPES-Tyrode zawierającym 10% roztwór cytrynianu sodu, 0,25 pM PGE1, 250 ng / ml PGI2 i U / ml apyrazy i odwirowano przy 800 g przez 5 min. W przypadku mysiego osocza bogatego w płytkę krwi mysią krew potraktowaną cytrynianem sodu otrzymaną od 6- do 7-tygodniowej myszy C57BL / 6 odwirowano przy 150 g przez 5 min. Frakcję osocza ponownie wirowano przy 150 g przez 2 min, a supernatant zebrano i odwirowano przy 600 g przez 5 min w obecności 0,5 (1 M PGE1 i 500 ng / ml PGI2. Osad zawieszono w buforze HEPES-Tyrode zawierającym 10% roztwór cytrynianu sodu, 0,25. M PGE1 i 250 ng / ml PGI2 i odwirowano przy 600 g przez 3 min. Płytki ponownie zawieszono w buforze HEPES-Tyrode zawierającym 2 mM CaCl2. Specyfika przeciwciał przeciw PDI dla ludzkiego i mysiego PDI. Umyte ludzkie płytki (1 x 108 płytek krwi / 100 ul) i mysz (1 x 109 płytek / 100 ul) osadzono w peletkach i solubilizowano w 100 ul buforu do lizy SDS (4% SDS i 6 M mocznika zawierającego 2 mM EDTA i koktajl inhibitora proteazy). Supernatant poddano elektroforezie w obniżonych warunkach i poddano immunoblottingowi z króliczym poliklonalnym przeciwciałem przeciw bydlęcemu PDI lub mysim przeciwciałem monoklonalnym RL90. W doświadczeniach wymagających uwolnienia z aktywowanych płytek krwi, płytki myszy (1 x 109 płytek / ml) inkubowano z 0,5 U / ml ludzkiej trombiny przez 5 minut w 37 ° C. Supernatant zebrano przez odwirowanie przy 1000 g przez 5 min, a następnie poddano dodatkowemu wirowaniu przy 5000 g przez 5 min, aby usunąć wszelkie resztkowe płytki. Supernatant natychmiast wykorzystano do testu aktywności PDI i immunoblottingu. Test aktywności myszy PDI. Aktywność mysiej PDI monitorowano za pomocą testu transhydrogenazy insuliny (29) i uwalnianego mysich płytek aktywowanych trombiną jako źródła mysiego PDI. Insulinę bydlęcą (1 mg / ml) w 250 .l 50 mM buforu Tris-HCl, pH 7,5, inkubowano z 50 .l mysiego płytek krwi w obecności lub pod nieobecność przeciwciała monoklonalnego RL90 lub kontroli IgG2a dopasowanej do izotypu, frakcja IgG króliczego poliklonalnego przeciwciała skierowanego przeciw pio- temu PDI lub nieimmunologiczna kontrola króliczej IgG lub bacytracyna A. Test turbidymetryczny redukcji disiarczku insuliny przez PDI zapoczątkowano 3 ml 100 mM ditiotreitolu, a reakcję monitorowano przy OD650 nm. ponad 60 min
[hasła pokrewne: bulging krążka międzykręgowego, brak odruchu kolanowego, przedszkole wesołe skrzaty pobiedziska ]