Krytyczna rola zewnątrzkomórkowej izomerazy dwusiarczku białka podczas tworzenia skrzepliny u myszy cd

Mediana zintegrowanej fluorescencji związanej z akumulacją płytek dla 28 skrzepów wytworzonych u 3 myszy wskazała wczesną akumulację tuż przed 50 s i szczytową akumulację w około 90. 100 s (Figura 3B). Mediana zintegrowanej fluorescencji związanej z PDI dla tych samych skrzeplin wykazywała wczesne pojawienie się fluorescencji związanej z PDI po około 10 s, z maksymalną fluorescencją przy około 70. 90 s (Figura 3C). Wyniki te wskazują, że początkowa ekspresja PDI występuje przed znacznym nagromadzeniem płytek. Źródło wykrytego PDI jest niejasne: początkowy PDI może pochodzić z komórek śródbłonka lub może pochodzić z innych komórek, a później nagromadzenie PDI prawdopodobnie pochodzi z płytek krwi, chociaż komórki śródbłonka lub inne komórki mogą się w nie przyczynić. Figura 3 Porównanie ekspresji PDI i akumulacji płytek. Królicze przeciwciała poliklonalne anty-PDI skoniugowane z Alexa Fluor 488 (0,3 .g / g BW) i fragmenty Fab przeciwciał anty-CD41 skoniugowanych z Alexa Fluor 647 (0,3 .g / g BW) wlewano do myszy 5 min przed tętniczkiem zranienie. (A) Czasowy przebieg pojawiania się sygnałów fluorescencyjnych związanych z PDI (zielony) i płytkami krwi (czerwony) w ciągu 180 s po wywołanym laserem uszkodzeniu ściany naczynia u myszy typu dzikiego w kontekście histologii mikrokrążenia w jasnym polu (kolumna 1) ). W eksperymentach kontrolnych przeciwciała anty-PDI zastąpiono nieimmunologicznymi IgG sprzężonymi z Alexa Fluor 488 (kolumna 2). (B i C) Mediana zintegrowanej fluorescencji płytek krwi (B) i mediana zintegrowanej fluorescencji PDI (C) po infuzji oczyszczonych z królika przeciwciał anty-PDI (krzywa 1; 28 zakrzepów, 3 myszy typu dzikiego) lub króliczych IgG nieimmunologicznych (krzywa 2, 32 zakrzepy, 3 myszy typu dzikiego) przedstawiono w stosunku do czasu po uszkodzeniu ściany naczynia. Reprezentatywny binaryzowany obraz jest pokazany w A, a kompletne zbiory danych tego i wielu identycznych eksperymentów są przedstawione w B i C, które wykreślają zintegrowaną intensywność fluorescencji wszystkich pikseli w obrazie, niezależnie od ich intensywności, jako funkcji czasu. . W celu dalszej oceny specyficzności oczyszczonego przez powinowactwo poliklonalnego przeciwciała anty-PDI in vivo, egzogenny bydlęcy PDI podawano w infuzji myszom jako konkurent dla PDI występującego w miejscu tworzenia skrzepu. Po obserwowaniu znakowania płytek i akumulacji PDI w 6 oddzielnych skrzeplinach, jak opisano powyżej, egzogenny bydlęcy PDI (100 .g) podawano przez cewnik dożylny i wytworzono 6 dodatkowych zakrzepów. W obecności krążącego egzogennego bydlęcego PDI, w skrzepie nie wykryto fluorescencyjnie znakowanej akumulacji przeciwciała anty-PDI, chociaż akumulacja płytek krwi nie została zmieniona (Dodatkowa Figura 1, dostępna online z tym artykułem; doi: 10,1172 / JCI34134DS1). Te eksperymenty pokazały, że oczyszczone przez powinowactwo przeciwciała anty-PDI, które akumulują się in vivo, są rzeczywiście przeciwciałami, które rozpoznają PDI. Inhibitor izomerazy tiolowej blokuje tworzenie płytek krwi i wytwarzanie fibryny. Bacytracyna jest inhibitorem PDI i innych izomerów tiolowych w rodzinie PDI. W celu określenia wpływu hamowania izomerazy tiolowej na odkładanie się fibryny i powstawanie zakrzepu płytek krwi po uszkodzeniu laserem, bacytracynę wlewano do krążenia myszy 5 minut przed uszkodzeniem ściany naczynia, a odkładanie fibryny i akumulację płytek rejestrowano jednocześnie. Kumulację płytek monitorowano w rozwijającym się skrzepie, stosując fragmenty Fab znakowane Alexa Fluor 647f przeciwciała CD41, i odkładanie fibryny monitorowano stosując przeciwciało swoiste dla fibryny znakowane Alexa Fluor 488a, które nie reaguje z fibrynogenem. Zwiększenie stężenia bacytracyny doprowadziło do zmniejszenia odkładania się fibryny i akumulacji płytek po uszkodzeniu ściany naczynia (Figura 4A). Dane ilościowe uzyskano za pomocą analizy wielu skrzeplin. Mediana zintegrowanej fluorescencji płytek i mediana zintegrowanej fluorescencji fibryny, przedstawiona w funkcji czasu skrzeplin powstałych po infuzji 0, 0,3, 1,5 i 5,0 mg bacytracyny na mysz, wskazała zależne od dawki hamowanie gromadzenia się płytek krwi (Figura 4B) i odkładanie fibryny (Figura 4C), które były w przybliżeniu równoległe. Przy dawce 5,0 mg bacytracyny nie zwizualizowano fibryny. Izomeraza tiolowa jest zaangażowana w posttranslacyjną modyfikację wielu składników, które są ważne w tworzeniu skrzeplin, w tym. IIbp3 i czynnik tkankowy (1). Hamowanie gromadzenia się płytek krwi i odkładania fibryny przez bacytracynę może być wynikiem zahamowania modyfikacji tych składników lub innych czynników zaangażowanych w tworzenie skrzeplin za pośrednictwem izomerazy tiolowej. Figura 4 Hamowanie tworzenia fibryny i akumulacji płytek u myszy typu dzikiego w zależności od rosnących stężeń bacytracyny A
[podobne: andzela allegro, bolimuszka, brak odruchu kolanowego ]