Pojedyncza mutacja nukleotydowa w mysim promotorze reniny zakłóca regulację ciśnienia krwi ad 7

W badaniu wykorzystano sześć par WT i mut TgM (8-tygodniowych). Jedną grupę traktowano przez 7 dni kaptoprilem rozpuszczonym w wodzie do picia (0,5 mg / ml). Nerki wyizolowano i RNA analizowano jak opisano w A. Linie w B i C wskazują, że ścieżki były prowadzone na tym samym żelu, ale nie były niejednoznaczne. * P <0,05; ** P <0,01. Następnie testowaliśmy, aby określić, czy ekspresja Tg Ren-1C w nerce może być zwiększona przez podanie kaptoprilu. Półilościowa analiza RT-PCR ujawniła, że poziom endogennej akumulacji mRNA dla Ren-2 i Ren-1D wzrósł 2- do 4-krotnie po leczeniu 8-tygodniowych myszy z kaptoprilem przez tydzień (Figura 4, B i C) . Zarówno w przypadku WT, jak i mutacji CNRE TgM, leczenie kaptoprylem zwierząt zwiększyło mRNA Tg Ren-1C w takim samym zakresie jak geny endogenne, co pokazuje, że CNRE jest zbędny w indukcji ekspresji genu reniny przez kaptopryl (Figura 4B). W mutacji RP-2 TgM akumulacja mRNA Tg Ren-1C była ledwo wykrywalna, nawet po traktowaniu zwierząt kaptoprilem, podczas gdy zwiększała się ona 3- do 4-krotnie w WT RP-2 TgM (Figura 4C). Ponieważ RP-2 / PPE jest wymagane do podstawowej transkrypcji genu Ren-1C w nerce, nie możemy określić na podstawie tego wyniku, czy ten element jest zaangażowany w indukcję ekspresji genu reniny przez captril. Przeanalizowaliśmy linie mutacji CNRE 525 i 546 oraz linie mutacji RP-2 399 i 1224 i uzyskano zasadniczo takie same wyniki w obu liniach, chociaż dane przedstawiono tylko dla linii 546 i 399 (Figura 4, ACH). Zdecydowaliśmy się użyć linii 546 i 399 do eksperymentu ratunkowego. Wytwarzanie myszy zrekombinowanych Ren-1C-BAC-Tg: Ren-1C. Aby ocenić fizjologiczne znaczenie elementów Ren-1Ccis, stworzyliśmy hodowlę, aby wprowadzić kopię BAC Tg (WT lub mut) na genetyczne tło Ren-1C. Null (Ren-1C. /.), Które pierwotnie generowane w inbredowym szczepie myszy C57BL / 6 (1). Aby ułatwić genotypowanie, najpierw przeszliśmy krzyżówkę wsteczną z Ren-1C. /. mysz z myszą ICR (5 pokoleń, Figura 5A), następnie krzyżowano z myszą ICR niosącą BAC Tg Ren-1C (BAC TgRen-1C). Potomstwo F1 (III), które są heterozygotyczne pod względem Ren-1C. Null i Ren-2 i Ren-1D alleli i hemizygotyczne pod względem BAC Tg (TgRen-1C BAC: Ren-1C + /.), Skrzyżowano z heterozygotą myszy dla Ren-1C. null i Ren-2 i Ren-1D alleli (Ren-1C + /.). Potomstwo F2 przeszukiwano, aby zidentyfikować mysią homozygotę pod kątem alleli zerowych Ren-1C, albo z (TgRen-1C BAC: Ren-1C (3 / r) lub bez (Ren-1C (3 / r) BAC Tc Ren-1C. . W krzyżach utracono endogenne fragmenty Ren-2 i Ren-1D (odpowiednio 7,2 i 6,7 kbp) i zysk fragmentu BAC Tg Ren-1C (5,8 kbp) potwierdzono za pomocą analizy Southern blot dla allelu DNA ogonowej końcówki (Figura 5B). Rycina 5BAC, w której pośredniczy ratowanie myszy zerowej Ren-1C. (A) Strategia hodowania dla wprowadzenia pojedynczej kopii WT lub mut BAC Tg Ren-1C do genetycznego tła Ren-1C. 2 i 1D, endogenne loci Ren-2 i Ren-1D; 1C-Tg, Ren-1C BAC Tg; 1C-zerowe, ukierunkowane locus Ren-1C; 1C; endogenne locus Ren-1C. (B) Analiza Southern blot w celu rozróżnienia genotypu. Ogon zakończony kończynami trawiono BamHI i hybrydyzowano z sondą genomowego DNA Ren-1C (fragment PstI-XbaI wokół eksonu 5), który hybrydyzował z pasmami diagnostycznymi z Ren-2 (7,2 kb) i Ren-1D (6,7 kb) Ren-1C lub Tg (5,8 kb) i loci o zerowej długości null (3,7 kb). (C) Analiza metodą Northern blot ekspresji genu reniny u myszy złożonych. Całkowity RNA z nerki dwumiesięcznych zwierząt hybrydyzowano z mysią sondą cDNA Ren-1C (fragment KpnI-NcoI, 820 bp) i sondą cDNA mysiej Gapdh (453 pz, nt 565 do 1,017, MUSGAPDH, nr dostępu w GenBank
[przypisy: bazofile niski poziom, co decyduje o stopniu zagrożenia życia poparzonego, bazofile poniżej normy ]