Pojedyncza mutacja nukleotydowa w mysim promotorze reniny zakłóca regulację ciśnienia krwi ad

Co ciekawe, ekspresja Ren-1 i Ren-2 różnią się znacznie w SMG, gdzie ekspresja Ren-2 jest ponad 100-krotnie wyższa niż w Ren-1 (7). Z powodu braku odpowiednich linii komórkowych, postęp w analizie transkrypcji genu reniny był powolny i generalnie wykorzystywał komórki wyrażające reninę spoza nerki lub komórki, które zazwyczaj nie wytwarzają reniny (8. 10). Jednakże w 1990 roku wyizolowano z myszy nerki Tg (TgM) komórkę podobną do JG, wydzielającą reninę, As4.1, niosącą konstrukt antygenu SV40a T promotora Ren-2 (11). Stosując As4.1 i inne linie komórkowe, zidentyfikowano kilka potencjalnych sekwencji reagujących na cAMP zidentyfikowano w obrębie promotorów genu reniny (patrz odnośnik 12). Pośród nich skupiliśmy się na 2 przypuszczalnych elementach reagujących na cAMP, CNRE (nakładający się element reagujący na cAMP [CRE] i negatywny element regulatorowy [NRE]) i RP-2 / PPE (element proksymalnego promotora reniny 2 / proksymalny element promotorowy) . CNRE został zidentyfikowany w 5. region flankujący zarówno mysiego Ren-1 jak i Ren-2, ale nie jest obecny w homologicznych genach ludzkich (od <603 do> 591 w stosunku do miejsca startu transkrypcji Ren-1C). Ten element nadaje responsywność cAMP poprzez współczynnik wiązania CRE (CREB) (13) lub LXR. czynnik transkrypcyjny (14, 15). Zaproponowano, że CNRE może również regulować zróżnicowaną ekspresję Ren-1 i Ren-2 w SMG (13, 16. 18). RP-2 / PPE zidentyfikowano w proksymalnym regionie promotorowym mysiego genu Ren-1C (w zakresie od ~ 75 do> 47, pozycje literatury 19, 20); analogiczne elementy są zachowane w promotorach Ren-1D, Ren-2, szczurzej i ludzkiej (21). Przez przejściową transfekcję konstruktów promotora Ren-1C do hodowanych komórek okazało się, że RP-2 / PPE bierze udział w podstawowej (19, 20), jak również indukowalnej przez cAMP aktywności transkrypcyjnej (22). Następnie zaproponowano, że kompleks HOXD10, PBX1b i PREP1 wiąże się z RP-2 / PPE i aktywuje promotor Ren-1C w komórkach As4.1 (21). Ze względu na wpływ pozycji, jakościowe i ilościowe cechy ekspresji Tg różnią się nawet między niezależnymi liniami TgM niosącymi identyczne konstrukty DNA. Dlatego, aby porównać poziomy ekspresji Tg między WT i loci zmutowanymi (mut), należy przeanalizować dużą liczbę linii TgM. Aby przezwyciężyć ten problem, przyjęliśmy kombinację dwóch technologii: transgenesis BAC i coplacement (23). Wstawki BAC (~ 200 kb) niosą więcej informacji genetycznej niż powszechnie stosowane plazmidy (~ 20 kb). Ponadto, geny przenoszone na BAC wydają się być bardziej odporne na działanie pozycji. Odpowiednio, na przykład, mysi klon BAC o masie cząsteczkowej 145 | xm (145 kbp) obejmujący allele Ren-1D i Ren-2 wykazywał odpowiedni wzór ekspresji w TgM (24). Kopiowanie Tg, które opisujemy poniżej, opiera się na rekombinacji za pośrednictwem Cre / loxP. Zastosowaliśmy technikę w tym badaniu w celu umieszczenia loci WT i mut w dokładnie tej samej pozycji w genomie, eliminując w ten sposób możliwe efekty pozycji. Wytworzyliśmy linie TgM zawierające DNA BAC Ren-1C o 155 kbp, z sekwencjami promotorowymi WT lub mut Ren-1C, obie zintegrowane w tym samym miejscu chromosomu (23, 25). Analizy tych zwierząt wykazały, że RP-2 / PPE w promotorze genu Ren-1C jest niezbędny do podstawowej aktywności transkrypcyjnej w nerce. Z drugiej strony, nie obserwowano żadnej znaczącej zmiany w akumulacji mRNA Ren-1C w tkankach testowanych w mutacji CNRE TgM. Ponadto, miejsce mutacji CNRE reagowało normalnie na modulatory transkrypcji genu reniny, takie jak obciążenie dużą ilością soli, odwodnienie i silny inhibitor enzymu konwertującego angiotensynę (kaptopril), który poważnie obniża BP. Wyniki te pokazują, że CNRE jest zbędna lub zbędna zarówno dla podstawowej, jak i aktywowanej ekspresji genu Ren-1C w odpowiedzi na typowe bodźce transkrypcyjne reniny. Następnie wygenerowaliśmy myszy z zerowym związkiem ren-1C-BAC-Tg: Ren-1C, aby ocenić fizjologiczne znaczenie mutacji cis, przez ustalenie, czy mogą one funkcjonalnie uratować fenotyp niskiego BP Ren-1C. Null (Ren-1C. /. ) myszy mut (1)
[więcej w: co decyduje o stopniu zagrożenia życia poparzonego, wesołe skrzaty pobiedziska, bazofile niski poziom ]