Związek Tgmut CNRE BAC: Ren-1C. /. myszy wykazywały profil ekspresyjny reniny, który był nie do odróżnienia od profilu TgWT CNRE BAC: Ren-1C. /. lub heterozygotyczne myszy Ren-1C (zerowe (Ren-1C + / y). Natomiast związek Tgmut RP-2 BAC: Ren-1C. /. myszy nie wykazywały ekspresji reniny w nerce. Odpowiednio, aktywność reninowa osocza (PRA), stężenie AI i skurczowe ciśnienie tętnicze (SBP) Tgmut RP-2 BAC: Ren-1C. /. myszy były znacznie niższe niż myszy kontrolne WT. Wyniki te pokazują, że homeostazę BP można regulować za pomocą mechanizmów transkrypcyjnych kontrolujących ekspresję genu reniny i że RP-2, ale nie CNRE, odgrywa kluczową rolę w tym mechanizmie. Wyniki Strategia kopiowania Tg do bezpośredniego porównania ekspresji genów. Połączone zastosowanie BAC Tg i strategia coplacement pozwoliły nam precyzyjnie ocenić aktywność in vivo dwóch kandydujących elementów cis-regulatorowych w genie reniny, tj. CNRE i RP-2 / PPE (Figura 1, B i C). CNRE jest elementem złożonym, składającym się z CRE i NRE. Aby określić, czy CNRE może uczestniczyć w reakcji na cAMP i / lub swoistość typu komórkowego, usunęliśmy wszystkie sekwencje CNRE z promotora Ren-1C (Figura 1B). Doniesiono, że RP-2 / PPE wiąże się z kompleksem czynników transkrypcyjnych HOXD10-PBXlb-PREP1 i że pojedyncza mutacja nt w elemencie znosi wiązanie czynnika i aktywację transkrypcji w komórkach As4.1 (21). Dlatego wprowadziliśmy tę mutację do sekwencji RP-2 / PPE (rysunek 1C). Ryc. 1Tg Strategia dzielenia. (A) Mysz Ren-1C BAC. Fragmenty restrykcyjne BstI o wielkości 155 kbp z 66 kbp i 80 kbp z 5. i 3. sekwencje flankujące, odpowiednio, zostały wykorzystane do mikroiniekcji. Pokazano elementy regulatorowe cis i 9 eksonów genu. (B, górna lewa) Mapa regionu promotorowego Ren-1C i struktura wektora kierującego (pTmRn / mutCNRE), w którym sekwencje WT (pole otwartego) i mut CNRE (mut; wypełnione pole), jak również sekwencje homologiczne do docelowe locus (grube linie) są zawarte. Przedstawiono miejsca enzymów restrykcyjnych z ich pozycjami względem miejsca startu transkrypcji (+1). Sekwencje loxP2272 i loxP5171 są pokazane odpowiednio jako otwarte i wypełnione trójkąty. Docelowe locus zostało wygenerowane w E. coli i użyte do ustalenia linii TgM. Po krzyżowaniu z TgM wyrażającym Cre, selektywne wycięcie w macicy segmentu DNA pomiędzy parą miejsc loxP5171 lub loxP2272 wygenerowało odpowiednio WT lub mut loci. (B, górna prawa strona) Wprowadzenie FRT (zacienione owale) i miejsca SfiI do 3 a -UTR genu. Rekombinację docelową i rekombinację Flippase / FRT (FLP / FRT) przeprowadzono w szczepie EL250 E. coli (26). Zestaw starterów PCR, który jednocześnie amplifikuje Tg i endogenne transkrypty reniny, jest pokazany strzałkami. (B, dół) Porównanie sekwencji promotorowych CNT i mutacji CNRE. (C, góra) Wektor celujący (pTmRn / mutRP-2) do modyfikacji RP-2. Uwzględniono zarówno sekwencje RP-2 WT (otwarte kółko) i mut (wypełnione kółko), jak i sekwencje homologiczne do celu (grube linie). Redukcję Tg przeprowadzono jak opisano w B. (C, dół) Porównanie sekwencji WT i mut RP-2. Motyw HOX / PBX jest w pudełku. Sekwencje kodujące Ren-1C (9 kb) są centralnie zlokalizowane w BAC RPCI23-240p23 (Figura 1). Aby odróżnić Tg Ren-1C od endogennych mysich sekwencji reninowych w analizie ekspresji i analizach strukturalnych, po raz pierwszy wprowadziliśmy miejsca docelowe rekombinacji f lupazy (FRT) i miejsca restrykcyjne SfiI (133 bp) do 3. Nieulegającego translacji regionu (3a -UTR) Ren-1C Tg przez zastosowanie homologicznej rekombinacji w E. coli (Figura 1B, patrz Metody dla szczegółów) (26). Ten BAC znakowany FRT był następnie modyfikowany niezależnie w regionie promotora (Figura 1, B i C)
[hasła pokrewne: bartoneloza, razer kraken allegro, choroba duhringa zdjęcia ]
Comments are closed.
Article marked with the noticed of: Schodołazy dla osób niepełnosprawnych[…]
Zasłyszane z SOR jednego z dużych miast Polski
[..] Oznaczono ponizsze tresci z artykulu oryginalnego: restauracje katowice[…]
Ból podbrzusza i swędzenie odbytu