Wczesne niepowodzenie punktu kontrolnego G2 / M jako mechanizmu molekularnego leżącego u podłoża aberracji chromosomowych wywołanych etopozydami ad 11

Komórki zebrano i utrwalono 0,34% formaldehydem, a następnie permeabilizowano 90% metanolem. Komórki barwiono monoklonalnym przeciwciałem fosfohistonowym H3 (Cell Signaling Technology), a następnie sprzężone z FITC przeciwciało drugorzędowe przeciw myszy (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) i barwienie PI, a następnie ponad 10 000 komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku testu z pominięciem fazy M komórki zsynchronizowano na granicy G1 / S za pomocą podwójnej bloku tymidynowego przy użyciu 2,5 mM tymidyny (MP Biomedicals LLC), a następnie uwolniono. W punkcie czasowym, w którym komórki gromadziły się w późnej fazie S / G2, znakowano je 10 .M BrdU (BD Biosciences A Pharmingen) przez 60 minut, a następnie płukano i inkubowano z różnymi stężeniami etopozydu przez lub 5 godzin. We wskazanych punktach czasowych, komórki zebrano, utrwalono i wybarwiono skoniugowanym z FITC przeciwciałem anty-BrdU (BD Biosciences A Pharmingen) po inkubacji z DNazą I (BD Biosciences. Pharmingen). Komórki wybarwiono 7-amino-aktynomycyną D (7-AAD) (BD Biosciences. Pharmingen), a komórki ujemne pod względem BrdU poddano analizie cyklu komórkowego za pomocą FACScan. Aby uniknąć dwukrotnego liczenia postmitotycznej frakcji G1, ponieważ komórki mitotyczne są podwojone w wyniku mitozy, obliczyliśmy MOI w następujący sposób. Algebry (a, b, c, d) są wskazane na Figurze 2E (a, procent komórek fazy G1, S i G2 / M przy godzinie traktowania; b, procent komórek G1 i wczesnych komórek fazy S po godzinie od c, procent komórek fazy G1, S i G2 / M po 5 godzinach leczenia, d, procent G1 i wczesna faza S po 5 godzinach leczenia). Prawa krawędzie b i d odpowiadają średniej ze średnich wartości intensywności 7-AAD komórek 2N i 4N. Przy założeniu, że X (= MOI) całkowitych komórek po godzinie leczenia przeszedł mitozę podczas leczenia (b + 2X): (a + 2X. X) = d: c. MOI oblicza się jako X = (da. Bc) / (2c. D). Względny procentowy stosunek MOI obliczono względem MOI kontroli wolnej od etopozydów jako procent kontroli MOI. Frakcjonowanie komórek. Schemat przepływu w procedurze frakcjonowania przedstawiono na fig. 3C. Komórki zostały zsynchronizowane przez blok tymidynowy, a następnie uwolnione. W momencie, w którym komórki gromadziły się w fazie G2 / M, były eksponowane na różne stężenia etopozydu. Komórki, które weszły w fazę M krótko po ekspozycji na etopozyd, zostały usunięte przez wytrząsanie. Pozostałe komórki umieszczono w świeżej pożywce o tym samym stężeniu etopozydu. Po leczeniu etopozydem przez 3 godziny, razem z kolcemidem przez ostatnią godzinę, frakcję bogatą w metafazę zebrano przez wytrząsanie, co umożliwiło nam zbieranie komórek z pominięciem wczesnego punktu kontrolnego G2 / M. Przylegające komórki pozostałe w kolbach zebrano jako frakcję bogatą w G2. Aby zebrać postmitotyczne komórki G1, komórki fazy M, które przesłoniły wczesny punkt kontrolny G2 / M, zebrano przez wytrząsanie po ekspozycji na różne stężenia etopozydu bez kolcemidu przez 3 godziny, a następnie ponownie inkubowano na płytkach powleczonych kolagenem o tym samym stężeniu etopozydu. . Pomitotyczne komórki G1 zbierano po dodatkowej 2-godzinnej reinkubacji. W przypadku premitotycznej frakcji bogatej w G1, komórki fazy M otrzymane przez wytrząsanie bez etopozydu inkubowano ponownie, aby umożliwić przejście do G1. Generacja długookresowych hodowanych komórek, które przeszły przez mitozę podczas leczenia etopozydem. Komórki GM05849C synchronizowano w G2 i eksponowano na 0 lub .M etopozydu. Po 60 minutach, komórki fazy M zebrano przez strząsanie, a następnie ponownie inkubowano na płytkach pokrytych kolagenem. Po 90 minutach komórki uwolniono z etopozydu i hodowano przez 20 dni bez etopozydu (kilka pasaży)
[patrz też: allegro hantle, wesołe skrzaty pobiedziska, choroba scheuermanna operacja ]