Wczesne niepowodzenie punktu kontrolnego G2 / M jako mechanizmu molekularnego leżącego u podłoża aberracji chromosomowych wywołanych etopozydami ad 12

Jako kontrole, komórki GM05849C traktowano 0 lub 1. M etopozydem w warunkach asynchronicznych przez 150 minut, a następnie uwalniano i hodowano bez etopozydu przez 20 dni. RYBY i statystyki. Bakteryjne sztuczne sondy chromosomowe (RP11-30E1, RP11-59N1) flankujące centromerowe i telomerowe końce genu MLL (sondy 11q23) izolowano w oparciu o bazę danych dostarczoną przez University of California. Santa Cruz (Human [Homo sapiens] Genome Browser Gateway ; http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Każdą sondę znakowano przez nic-translację biotyna-16-dUTP lub digoksygeniną-11-dUTP (Roche Diagnostics Corp.) i stosowano do hybrydyzacji. Specyficzne sygnały dla sond znakowanych biotyną i digoksygeniną wykrywano za pomocą awidyny FITC (Roche Diagnostics Corp.) i anty-digoksygeniny-rodaminy (Roche Diagnostics Corp.), odpowiednio (48). Sondy CH11C, specyficzne dla centromeru chromosomu 11, wyznakowane SpectrumGreen (sonda CH11C), sparowane sondy obejmujące gen MLL z minimalnym nakładaniem w BCR (sondy MLL) i całą sondę do malowania chromosomem specyficzną dla chromosomu 11 otrzymano z VYSIS i przetworzono zgodnie z protokołami dostarczonymi przez producenta. Obrazy uzyskano na mikroskopie Optiphot-2 firmy Nikon przy powiększeniu x 600 z aparatem Photometrics CH250. Do zliczania sygnałów rozszczepionych w fibroblastach pozbawionych ATM, badano co najmniej 150 komórek, które nie wykazywały wzmocnienia lub utraty sygnałów na każdym etapie cyklu komórkowego dla każdej frakcji w każdym eksperymencie (średnio 165 komórek). Dane uzyskano z 3 oddzielnych doświadczeń. Ponieważ częstotliwości sygnałów dzielonych w niektórych grupach były bardzo rzadkie, a odsetek komórek z sygnałami dzielonymi w 3 grupach eksperymentalnych nie różnił się istotnie (P = 0,16, test Cochrana-Mantela-Haenszela, po skontrolowaniu poziomów stężenia leku i cykle komórkowe), wszystkie dane z tych 3 niezależnych eksperymentów połączono do analizy. Dane uzyskano z 3 oddzielnych eksperymentów i połączone dane analizowano pod względem istotności statystycznej, stosując dokładny test Fishera, po dostosowaniu do wielokrotnych porównań z użyciem metody Bonferroni-Holm (3 porównania przy każdym stężeniu leku). Różnice uznano za statystycznie istotne przy P <0,05. Wskaźniki szans i 95% przedziały ufności oszacowano za pomocą modelu regresji logistycznej. Komórki U2OS okazjonalnie mają 3 sygnały locus MLL w normalnej hodowli, jak określono przez sondy MLL. Zatem określenie fazy cyklu komórkowego każdej komórki U2OS było niemożliwe. Z tego powodu 150 komórek U2OS zliczono dla sygnałów dzielenia MLL we frakcjach. Dwa niezależne eksperymenty połączono do analizy statystycznej z wyżej wymienionego powodu. Istotność statystyczną różnic pomiędzy proporcjami komórek z rozszczepionymi sygnałami między frakcjami analizowano za pomocą dokładnego testu Fishera, po dostosowaniu do wielokrotnych porównań z zastosowaniem metody Bonferroni-Holma. Różnice uznano za statystycznie istotne przy P <0,05. Wskaźniki szans i 95% przedziały ufności oszacowano za pomocą modelu regresji logistycznej. Analiza a-H2AX. Komórki fazy M zebrano po ekspozycji na 4 .M etopozydu przez 3 godziny, a następnie ponownie inkubowano z tym samym stężeniem etopozydu przez 30 minut. Następnie inkubowano je w pożywce wolnej od etopozydów przez 0, 30, 90 lub 120 minut i poddano obróbce w celu analizy metodą cytometrii przepływowej. Komórki zabarwiono skoniugowanymi z FITC przeciwciałami anty-H2AX (Upstate) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta, po którym następowała obróbka RNaseA i barwienie PI. Ponad 10 000 komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Neutralny test kometowy. Komórki przetwarzano przy użyciu zestawów Comet Assay (Trevigen Inc.) zgodnie z protokołami dostarczonymi przez producenta [podobne: bliznowiec po operacji, chondropatia rzepki, co decyduje o stopniu zagrożenia życia poparzonego ]