Wczesne niepowodzenie punktu kontrolnego G2 / M jako mechanizmu molekularnego leżącego u podłoża aberracji chromosomowych wywołanych etopozydami ad 5

Oryginalne powiększenie zdjęć FISH, × 600. G2, M i postmitotyczne komórki fazy G1 fibroblastu z niedoborem ATM zbierano sekwencyjnie przez frakcjonowanie z zastosowaniem podwójnej blokady tymidynowej i metody shake-off (Figura 3C i Metody). Najpierw policzono liczbę sygnałów CH11C i centromerowych 11q23 (Figura 1A) w celu potwierdzenia, czy komórki podzielono symetrycznie po ekspozycji na 2. M etopozyd. Ponad 96% komórek metafazy wytworzyło 4 sygnały CH11C, a hybrydyzacja równoległa z sondą centromerową 11q23 ujawniła 2 replikowane sygnały w 95% komórek metafazy w obecności lub nieobecności 2. M etopozydu, zgodnego z pierwotnymi cechami cytogenetycznymi. Większość postmitotycznych komórek G1 także wykazywała 4 sygnały CH11C i 2 centromerowe sygnały 11q23 w nieobecności etopozydu. Odkrycia te kontrastowały z wynikami uzyskanymi w przypadku komórek G1 z postmitotią, leczonych etopozydem, z których 30% wykazywało wzmocnienie lub utratę centromerowych sygnałów 11q23 (Figura 3D) pomimo faktu, że 92% tych komórek miało 4 sygnały CH11C (Figura 3E). . Obserwacje te wskazują, że etopozyd indukuje DSB DNA na chromosomie 11 między centromerem i centromerowym końcem pasma q23, a podczas gdy segmenty centromerowe segregują symetrycznie przez mitozę, segmenty telomeryczne skutkują asymetrycznym rozkładem w komórkach potomnych. Po traktowaniu 2 .M etopozydu, mikrojądra były czasami widoczne we frakcji bogatej w postmitotyczną G1. Sygnał centromerowy 11q23 pozbawiony sygnału CH11C obserwowano w 8% mikrojąder (P <0,0001, dokładny test Fishera, n = 250, Figura 3F). To odkrycie jest zgodne z interpretacją, że rozszczepione fragmenty chromosomalne utrzymują się w fazie M, a segmenty telomeryczne rozszczepionych chromosomów rozdzielają losowo w mikrojądra. Dzielenie sygnałów 11q23 w leczonych etopozydem postmitotycznych komórkach G1. Następnie skoncentrowaliśmy się na locus genu MLL z fibroblastami pozbawionymi ATM, które otrzymały etopozyd, przy użyciu sond 11q23 (rysunek 1A). Profil cyklu komórkowego określono na podstawie rozmiaru jądra, kondensacji chromatyny i lokalizacji sygnału sondy (Figura 4, A i B). Gdy fibroblasty pozbawione ATM były hodowane bez etopozydu, dysocjacja sygnałów FROM (centromerowych (zielonej) i telomerowej (czerwonej) była rzadko obserwowana w G2 (Figura 4A), metafaza (Figura 4B), postmitotyczna G1 lub premitotyczne komórki G1. Gdy inkubowano je z 2 lub 4 .M etopozydem, postmitotyczne komórki fazy G1 (figura 4C) i komórki metafazowe (figura 4D) wykazywały częste dysocjacje sygnałów centromerowych i telomerycznych 11q23, chociaż znacznie mniej wyraźne w tych ostatnich (Tabela i Figura 4E). Przeciwnie, tylko kilka komórek pozostających w fazie G2 lub premitotycznej G1 podczas ekspozycji na etopozyd wykazywało sygnały podzielone (Tabela 1). Wyniki te wskazują, że fibroblasty pozbawione ATM zbierają chromosomalną segregację w 11q23 podczas przechodzenia cyklu komórkowego od G2 do fazy postmitotic G1 w obecności etopozydu. Rozszczepienie genu MLL w fibroblastach z niedoborem ATM było bardziej bezpośrednio potwierdzone w leczonych etopozydem postmitotycznych komórkach G1 przy użyciu sond MLL (podzielone sygnały. Komórki dodatnie były obecne w 10,7% [2. M] versus 2,4% [0. M]; P <0,0001, dokładny test Fishera, n> 300 komórek dla każdego, Figura 1A). Rycina 4Segregacja końców DNA odszczepianych przez etopozydy. (A i B) Fibroblasty pozbawione ATM, z niedoborem ATM, hybrydyzowano z sondami centromerowymi (zielonymi) i telomerowymi (czerwonymi) 11q23. (A) G1 (komórka z małym jądrem z 2 kopiami sygnałów 11q23) i G2 (komórka z dużym jądrem z 2 zestawami replikowanych sygnałów 11q23) komórek fazowych
[hasła pokrewne: choroba dercuma, allegro hantle, bulging krążka międzykręgowego ]