Wczesne niepowodzenie punktu kontrolnego G2 / M jako mechanizmu molekularnego leżącego u podłoża aberracji chromosomowych wywołanych etopozydami ad 6

Segregacja segmentów 11q23 w 2. M etopozydowych fibronektach z niedoborem ATM zidentyfikowanych przez dysocjację sygnałów centromerowych i telomerycznych 11q23. (C) Postmityczne komórki fazy G1. (D) Komórka metafazowa. Oryginalne powiększenie zdjęć FISH, × 600. Obszar zamknięty przez każdy prostokąt zostanie powiększony w dolnym rzędzie. (E) Proporcja podzielonych komórek sygnałowych 11q23 sygnału w każdej frakcji. Wszystkie dane z 3 niezależnych eksperymentów połączono do analizy (n> 450 na każdą). Pionowe linie wskazują 95% przedziały ufności. Różnice w odsetku komórek zdysocjowanymi sygnałami analizowano za pomocą dokładnego testu Fishera po skorygowaniu dla wielokrotnych porównań metodą Bonferroni-Holma (3 porównania przy każdym stężeniu leku). * P <0,0001. Tabela Iloraz szans proporcji fibroblastów pozbawionych ATM z sygnałami sond podzielonych na 11q23 według ekspozycji na lek w każdej fazie cyklu komórkowego Lokus 11q23 także segreguje w komórkach U2OS. Linia komórkowa kostniakomięsaka U2OS ma wysokie MOI pod leczeniem niskopodawkowym etopozydem pomimo normalnej funkcji ATM analizowanej przez fosforylację p15 Ser15 (35) indukowaną napromienianiem jonizacją (Figura 2F). Odpowiednio, komórki U2OS analizowano pod kątem sygnałów podzielonych na sondy MLL w taki sam sposób, jak komórki z niedoborem ATM (opisane powyżej) i stwierdzono, że mają zwiększoną częstotliwość rozszczepionych sygnałów MLL we frakcji pomitytycznej traktowanej etopozydem G1 (Tabela 2 ). Obserwacje te wskazują, że segregacja pęknięć chromosomowych w dniu 11q23 jest ogólnie związana z wczesnym defektem punktu kontrolnego G2 / M. Tabela 2 Wartości procentowe i OR komórek U2OS z rozszczepionymi sygnałami MLL według ekspozycji na lek w każdej frakcji DNA DSB pozostające nienadzorowane wkrótce po powrocie mitozy w fazie postmitotycznej G1. Fosfo-histon H2AX (a-H2AX) sekwencyjnie monitorowano w celu określenia ilości DSB DNA (36) we fibroblastach pozbawionych ATM G1 po endotoksynie. Frakcję bogatą w M zebraną po traktowaniu etofosydem 4 .M ponownie inkubowano z etopozydem przez 30 minut, aby umożliwić progresję do postmitotycznej fazy G1. Następnie zostały uwolnione z etopozydu (Figura 5, Bd). Postmitotyczne komórki G1 z zawartością DNA 2N i komórkami pozostającymi w mitozie z zawartością DNA 4N silnie zabarwioną na obecność P-H2AX w czasie 0 (Figura 5A). Przeciwnie, po 30 minutach leczenia etopozydem komórki uprzednio zsynchronizowane na G1 (premitotyczny G1, Figura 3C) nie zwiększyły a-H2AX (Figura 5A). Dane te sugerują, że znaczne ilości DSB w pozytotycznych komórkach G1 leczonych etopozydem indukowano podczas fazy G2 i / lub M i że te DSB pozostały nienaprawione wkrótce po mitozy. Wysokie natężenie barwienia a-H2AX w postmitotycznych komórkach G1 utrzymywało się przez okres do 30 minut po usunięciu etopozydu, ale zaczęło spadać z 90 minut i osiągnęło poziom tła 210 minut później (Figura 5B). Zmniejszenie barwienia a-H2AX nie było spowodowane śmiercią populacji P-H2AXy, zgodnie z wynikami analizy subdiploidalnej DNA do wykrywania komórek apoptotycznych (Figura 5C). Neutralny test kometowy, inny sposób mierzenia DSB z komórkowego DNA, wykazał znaczący moment końca komety w komórkach traktowanych 4. M etopozydu w czasie 0, ale zniknęło to o 210 minut. (Figura 5D). Wyniki te są zgodne z interpretacją, że złamane DNA, w tym segregowane chromosomy, są naprawiane podczas przechodzenia przez M do postmitotycznych faz G1, co prowadzi do tworzenia translokacji chromosomalnych. Figura 5DB DSB są naprawiane w fazie postmitotycznej G1. (A) Analiza metodą cytometrii przepływowej dla a-H2AX i zawartości DNA. Komórki analizowano w przypadku pozaprotetycznych wzbogaconych w ETM i 4M M submitycydów i premitycznych frakcji bogatych w G1. [hasła pokrewne: bazofile niski poziom, razer kraken allegro, chondropatia rzepki ]